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セパレーション・サイエンスへようこそ

 
 

セパレーション・サイエンスは、クロマトグラフィー及び質量分析技術に携わる皆様のための基礎、実践そしてトラブルシューティングに関する情報をお届けする、業界最前線のポータルサイトです。さまざまな記事・アプリケーションを特集し、併せてウェビナー、ワークショップ、そしてカンファレンスを開催することで、"すぐに使える"情報を発信しています。

 
 
 
 
 

基礎

私のお気に入り(1)

私の最初の仕事は、アメリカ、ニューヨーク州のタリータウンにあるTechnicon Instruments Corporationでの勤務でした。当時の上司であったLloyd Snyder氏は、良き友人であるとともに、現在まで約26年もの間、ずっとビジネスパートナーでもあります。彼とJack Kirkland氏が執筆した"Introduction to Modern Liquid Chromatography"の第2版(1979年出版)の草稿を確認する仕事を彼から与えられた時、当時私は、自分の将来に何が待っているのか予想することもできませんでした。

 

LC-MS: 事前準備を万全に

以前のHPLC Solutionsの12号から14号で、緩衝液に関して解説しました。その中で、分析法に応じて適した緩衝液があること、避けるべき緩衝液調製方法があることなどについて解説しました。この記事を読まれた読者の方(I.M.)からのご質問により、LC-MS装置使用時のLC-UV検出法の使用を可能にする、賢明で実用的な緩衝液のことを思い出しました。

 

基本に戻りましょう第一回:保持係数

これから数回に渡って、HPLCの初級コースを訪れましょう。分離の評価、方法開発や問題原因調査に関係する実用性に重点を置いた、HPLCで使われている様々な基本的な計算について見てみましょう。

 

基本に戻りましょう第2回: t0

前号では、保持係数kについて、どのように計算するのか、あるいは、どのように見積もるのかについて紹介しました。どちらのやり方で算出するにしても、カラムのデッドタイムt0 を知る必要があります。

 

基本に戻りましょう第3回: tR-t0診断

過去2回にわたって、保持係数kおよびカラムデッドタイムt0 の求め方について紹介しました。今回は、これまでに計算に用いてきた数字のうちのいくつかを用いた、HPLC分離における問題の診断法について解説します。

 
 

メソッド

S/N(信号/ノイズ比)の重要性

S/N比(信号/ノイズ比)は,あなたの測定方法の質に影響を及ぼす重要な可変要素です。

 

LC-MSにおけるキャリブレーションとチューニングの違い

質量スペクトル検出器を装備したHPLCが適切な質量情報を記録しているか,また検体検出に適切な設定となっているか,これらの確認に用いられる2つの手順についてお話します。

 

Genetic Drift

読者からのHPLC分析法に関する質問に答えたり、Journal of Chromatography誌への投稿論文を審査している時に、私は、喜ぶべきか、あるいはがっかりするべきか、分からなくなることがあります。HPLC分析法が、いったいどれくらいの頻度で、私がgenetic driftと呼んでいる変化を受けてきたのか、驚きを感じます。現在のHPLC分析法は、新しい問題を解決するために、それ以前の分析法を、ずっと微調整してきた結果、出来上がってきたからです。今回は、その一例について紹介します。

 

分析法の直線性

今回のHPLC Solutionsでは、John Dolanが分析法の直線性に関して、読者の質問にお答えます。

 
 

カラム

カラムは全部が同じにはできておりません

Q:C18カラムを用いる安定性を表示する検証分析法があります。別のメーカーにも同じC18カラムがあって,そのメソッド(手順書)に提示されているカラムの半分の値段で入手が可能です。カラムを(別のメーカーのものに)変えたら,その分析は無効なものになってしまうでしょうか?

 

固定相のデウェッティング(脱濡れ)とは?

HPLCにおける固定相のデウェッティング(Phase dewetting)は,固定相の崩壊 ( phase collapse)と呼んでいたものと同じプロセスです。固定相のC18グループでは表面にケバがあるテニスボールのように描かれることが多いのですが,C 18カラム装填に用いられる微粒子は,固いスポンジに似て全体的に多孔質です。

 

空気によってカラムは破損しますか?

Q:HPLCシステムの夜通しの作業の際に,たまたま溶媒を切らしてしまいました。ポンプの低圧力限界設定を起動しておかなかったため,ポンプは夜中まで空気を送り込んだのです。これによってカラムはだめになってしまいますか? もし大丈夫なら,どうやったら空気を全部排出できるのでしょうか。

 

細孔の大きさと粒子の大きさ

Q:HPLC充填材の細孔と粒子の大きさの関係はどのようなものですか?

 

IPカラムの洗浄

Q:カラムからイオン対試薬を洗い流すのは難しいと思います。最良の方法を教えてください。

 
 

移動相

バッファーの準備

Q:HPLCの移動相の水性部分をpH 2.5に調整するためにトリフルオロ酢酸(TFA)を用いています。どんなに注意深くpH調整を行なっても,移動相の新しいバッチを準備するたびに保持時間に変化が見られるのです(図1参照)。一回のバッチ内では保持時間は一貫しているようですが,バッチごとに変動することが気になります。この問題を解明していただけませんか?

 

意図しないイオン対 -ドデシル硫酸ナトリウム

HPLCのルーチン分析において、同一バッチ内における保持時間のズレは悩みの種です。前号では、多くのHPLC法において、最初の数回の試料注入時に見られる保持のドリフトについて紹介しました。これは、多くの場合、移動相あるいは試料成分のカラムに対する平衡化が遅いことと関係しており、しかも、大抵、最初の3、4回の試料注入の後には、この現象は見られなくなってしまいます。

 

バッファーの寿命

最近数回にわたって紹介してきた、緩衝液の使用に関する種々の側面(HPLC Solutionsの12、13、14および20号など)を読んで下さった読者の一人(D.B.さん)から、調製した緩衝液がどれくらいの期間使用することができるのか、という質問を頂きました。緩衝液の寿命に関しては、二つの見方があります。一つは、それが緩衝液としてどれくらいの期間、有効であるのか。二つ目は、緩衝液の他の性質との関係、特に、緩衝溶液内での微生物の増殖です。

 
 

アプリケーション

ACQUITY UPLC H-Class Bioシステムによるイオン交換クロマトグラフィー分析法開発

タンパク質の性質を、物理学的に、また化学的にも明らかにするためには、様々な分析法を用いなければ
なりません。イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質の分離や、脱アミド化などの翻訳後修飾による
チャージバリアントの存在を評価するためによく使われる分析法です。イオン交換クロマトグラフィーの分
析法開発では、移動相のpHが最も重要なパラメーターとなります。しかし、様々なpHの移動相を使用する実
験は時間と労力を要します。ACQUITY UPLC® H-ClassBioシステムではUPLC®テクノロジーとAuto•Blend
Plusテクノロジーを使用することにより、IEXでの分析法開発を簡便化します。
 

ACQUITY UPLC H-Class システムを用いた ヒスタミンの迅速分析

ヒスタミンは 、魚介類やその加工品を不適切な環境下や長期間保存すると、ヒス タミン生成菌 により、含まれる遊離ヒスチジンの脱炭酸反応が起こり、生成されま す。このヒスタミンを 多量に摂取すると、アレルギー様の食中毒として発疹や吐き気、下痢、 腹痛などを引き起こします。

 

ACQUITY UPLC H-Classシステムによる食品中の食品添加物の分析

平成22年5月厚生労働省から食安基発0528第4号が通知され、食品中の食品添加物法の一部が改正されまし
た。この通知には、ステアロイル乳酸ナトリウムが添加物として指定されたことに伴う分析法の設定と、安息香酸及び安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ 安息香酸 エステル類並びにプロピオン酸及びその塩類の分析法の改正が含まれ ています。
 

Agilent 5977A GC/MSD を用いた ウィスキーの香気成分のケモメトリクスプロファイリング

エクストラクタEI イオン源を搭載した高感度のAgilent 5977A シリーズGC/MSD に、ノ ンターゲット化合物分析と統計解析の手法を組み合わせ、化合物プロフィールを作成  し、5 種類のブランドのウィスキーを識別しました。

 

GC/Q-TOF による、マウス脳における 鎮静剤誘発性変化のメタボロミクス分析

マウス脳において鎮静剤が誘発する代謝変化を解明する研究を実施しました。Agilent 7200 シリーズGC/Q-TOF MS のEI MS、EI MS/MS、PCI 機能と、Agilent MassHunter ソフ トウェアを組み合わせることで、代謝変化の特定に対応できる、きわめて柔軟性の高い 包括的なワークフローが実現しました。このワークフローを用いて、モルヒネ感受性マウス株とモルヒネ耐性マウス株を区別し、モルヒネ投与に対するそれぞれの反応の違いを測定し、各種のテクニックを用いて化合物を同定しました。

 

GC/Q-TOF による、違法薬物押収物中のヘロインの特性解析および分類

ノンターゲット GC/Q-TOF 分析アプローチを使用して、ストリートヘロインサンプルの識別に成功しました。Agilent Mass Profiler Professional ソフトウェアの統計分析ツールを使用して、未知サンプルが所属するサンプルグループを 90 % を超える真度で確認するサンプル予測モデルを構築しました。

 

クロマトグラムの比較(異同判定)が容易!   GCクロマトグラムのパターンマッチングツール MatchCompareソフトウェア

 

MatchCompare ソフトウェアは、サンプル間の違いを可視化し、クロマトグラムの比較

(パタ-ンマッチング)を容易にするOpenLAB CDS 用のアドオンソフトウェアです。

判定基準は、保持時間とピーク面積(Area %)です。

 

デュアルFID およびキャピラリ・フロー・テクノロジーDeans スイッチを使用したC1~C6 パラフィン/オレフィン異性体分離 を含むC1~C10 炭化水素分析

キャピラリ・フロー・テクノロジー(CFT) Deans スイッチを使用して、冷媒によるオーブン冷却を使わずに、1 回の注入でC1~C10 の炭化水素の分析が可能なガスクロマトグラフ用メソッドを開発しました。このアプリケーションノートでは、C1~C6 のパラフィンおよびオレフィンの高分離分析のほか、気体および液体サンプルの両方においてより 幅広い炭化水素分析が可能となるメソッドについて解説します。

 

トリプル四重極 GC/MS/MS による 残留農薬スクリーニング MRM Screening

<要旨> 選択性に優れるトリプル四重極のMRMと農薬サロゲート物質を内標とした半定量メソッドを確立しました。抽出→精製した検液にサロゲート物質と擬似マトリックスを添加するだけで半定量をすることができるメソッドです。実際の農産物および果実抽出液に適用したところ、90%以上の農薬で添加濃度の50-200%の間で半定量値が算出されました。

 

ヘリウムガスの消費量削減ソリューション

近年のヘリウム(He)ガス供給問題、価格高騰により、ガスの消費量を削減したいというニーズが高まっており、アジレントでは、様々なソリューションを提供しております。

 

工具なしでGCカラム接続を実現!

簡単・確実に接続できる手締めナット

 新製品のAgilent セルフタイトカラムナットを使用することで、キャピラリカラムの注入口及び 検出器(質量検出器を含む)への取付が容易になり、また、リークのリスクが低減できます。

 

画期的な Agilent 独自のSelf-Cleaning イオン源。  イオン源の汚れを最小限に抑制し、データの安定性を向上

画期的なSelf-Cleaning イオン源は、イオン源の汚れを最小限に抑制し、データの安定性を向上させるアジレントの特許技術です。このイオン源を搭載した質量分析計には下記のような利点が付加されます。

→イオン源のメンテナンス(洗浄)の手間がなくなる。(または、大幅に減少)

→ 質量分析計が常に安定し、機器のダウンタイムを最小限に抑制。

→ レスポンスの安定性、直線性の向上といったデータ品質の向上。

多環芳香族炭化水素(PAHs )への適用の他、農薬やフタル酸エステル類といったアプリケーションにも対応が可能です。

 

超高感度トリプル四重極GC/MSシステム Agilent 7010(新製品)

Agilent 7010 トリプル四重極 GC/MS システムは電子イオン化 (EI) モードで業界初のアット (10 のマイナス 15 ) グラムレベルの機器検出下限を提供します。

新設計の超高感度 EI イオン源は従来のイオン源の 20 倍ものイオンを生成し、ワークフロー全体の効率を改善します。

この超高感度性能により、サンプルの前処理の削減、サンプルの注入量の削減などにより、メンテナンス頻度を削減することができ、ラボのオペレーティングコストを削減することができます。

 
 

クロマトグラム

イオン化合物では2つのピークが得られるのですか?

Q:リテンション(保持時間)は化合物のイオン化によって変化することはわかります。化合物がイオン化されると,一般的にリテンションはイオン化されなかった場合と比べて短くなります。化合物がpKa(酸解離定数または酸性度定数)に近づき,半分イオン化された場合は,2つのピークを予期すべきだという意味でしょうか?

 

 

溶媒ノモグラフ

HPLCの方法開発の際に、選択性を変化させるために使用可能で、最も効果が大きいパラメーターは、溶媒種類の変更です。例えば、グラジエント溶離の際のB溶媒を、アセトニトリル(ACN)から、メタノール(MeOH)やテトラヒドロフラン(THF)に変えることが可能です。

 

保持のドリフト

皆さんは、この現象をどれくらい経験されてきたでしょうか?HPLCのカラムに移動相を30分間流して、十分に平衡化させたと思っても、最初の3、4回の試料注入では、保持時間が少しずれて、最終的には更に2-3回程度試料注入を行った後で保持時間が落ち着く現象です。

 

テーリングの比較

前号では、ピークテーリングの計算法を紹介しました。本号では、いくつかのピークテーリングの例について詳しく見てみましょう。そして、それらが実際に、何を物語っているのかを見てみましょう。

 

温度と保持

これまでに、カラム温度として"室温"と明記されているHPLC分析法を見たことがありますか?このような記述は、その分析法において、潜在的な問題が今後起こり得る可能性のあることを示す、一つの良いサインであると言えます。今回は、"室温"の解釈について少しだけ振り返りますが、最初に、分離に対する温度の影響について見てみましょう。

 
 

ハードウェア

高圧,あるいは低圧ミキシングの違い?

Q:高圧ミキシングと低圧ミキシングは,どちらが良いのですか?

 

PEEKチューブ ─ その長所と欠点

PEEK(ポリ・エーテル・エーテル・ケトン)チューブは,多くのHPLCシステムの運用において標準的なアイテムになってきました。便利で廉価,そして内径が簡単に確認できるからです。けれども,このPEEKチューブに付きものの問題を回避するためには,注意が必要です。

 

汚染されたTFA

今回のHPLC Solutionsでは、グラジエントHPLC法におけるTFAの使用に関する読者の方からの質問に、特に、カラムの寿命およびベースラインに重点を置きながらJohn Dolanがお答えします。

 

TBAとESI

今回のHPLC Solutionsでは、エレクトロスプレーインターフェイス(ESI)を備えたLC-MSにおいて、10mMのトリブチルアミン(TBA)をイオン対として用いたイオン対クロマトグラフィーを行う際に、発生した問題についての読者からの質問に対して、John Dolanがお答えします。

 

シリンジからのコンタミネーション

今回のHPLC SolutionsではJohn Dolanがシリンジからのコンタミネーションに関して、読者の質問に答えます。

 
 
 

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ACQUITY UPLC H-Class Bioシステムによるイオン交換クロマトグラフィー分析法開発

タンパク質の性質を、物理学的に、また化学的にも明らかにするためには、様々な分析法を用いなければ
なりません。イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質の分離や、脱アミド化などの翻訳後修飾による
チャージバリアントの存在を評価するためによく使われる分析法です。イオン交換クロマトグラフィーの分
析法開発では、移動相のpHが最も重要なパラメーターとなります。しかし、様々なpHの移動相を使用する実
験は時間と労力を要します。ACQUITY UPLC® H-ClassBioシステムではUPLC®テクノロジーとAuto•Blend
Plusテクノロジーを使用することにより、IEXでの分析法開発を簡便化します。
 

HPLCシステム間での分析法移管

HPLC分析法と比較して分離、感度、スループット、生産性のすべてを向上させることができるUPLCテクノロ
ジーは製薬業界の研究開発部門(R&D)にいち早く導入されてきました。現在では数多くの新薬開発プロジェクトにおいてUPLCが採用されています。現在の分析法を再検討しなければならないようなルーチン分析を実施しているラボと比較すると研究開発部門では、新規システムの導入時にUPLCを導入することはそれほど複雑なことではありません。